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2-D Electrophoresis

分析服务

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Sample Preparation

为了根据等电点第一次分离试料蛋白质,必须清除试料中的salt、nucleic acid、polysaccharides、lipid等。

特别是salt,必须使用试料的Methanol precipitation、TCA/acetone precipitation、centricon进行清除,才能避免Isoelectrofocusing时,不会出现strip烧焦的问题。

为了按照MS compatible silver或者Sypro-Ruby staining标准,在理想状态下发现分析蛋白质需要100 – 200 ug/gel,进行Coomassie Blue staining,则需要1- 2 mg/gel的蛋白质量。
(normal gel:18 cm标准)为了解不同试料最佳分离条件而需进行预备试验时,需要更多量的试料。

不同试料所需蛋白质的大致浓度
细菌 干燥量的50%为蛋白质量
血浆/血清 60 mg/ml
1×107 真核细胞 1 mg
Mammalian tissue 在冷冻干燥的10 mg组织中,可提取1 mg的试料蛋白质
尿 约 500 ml
*利用MS准备蛋白质鉴定试料时,需特别注意不要被keratin污染。
*因Keratin导致的试料污染,会给蛋白质鉴定带来严重影响。
1. 进行MALDI-TOF分析时至少需要100 ng以上,进行LC-ESI MS/MS分析时至少需要3 pmol以上的蛋白质。
2. spot的大小为1mm左右,必须最大限度地按最小规格从凝胶上分离。
3. 为清除并浓缩试料的desalting、detergent,建议使用ZIP tip。
(通过silver staining获取的试料必须经过上述过程。)
4. 从凝胶中分离的蛋白质带放入盛有Type III水的1.5 ml tube中即可。

Gel Staining

利用电泳法分离的凝胶(1DE, 2DE)需经过染色阶段。
由于染色试剂存在敏感度差异,为了查看精确的蛋白质位置与定量图像,必须采用高敏感度染色试剂。
Proteome Tech大多采用自主研制的染色试剂。凭借长期以来积累的经验技术提供高清晰度图像。

考马斯蓝(Coomassie Blue)染色

利用Proteome Tech自主研制的CoomassiePro (G250)提供高敏感度图像。
较之其他产品敏感度更高,留出4~overnight的染色时间,即可看到更为精密的蛋白质图像。
并且,进行质量分析时脱色(destaining)过程简单,可以为客户节约宝贵的时间。
经过Coomassie blue染色的样品在进行质量分析时大多可被鉴定。

银(Silver)染色

采用Proteome Tech自主制造的modified silver进行染色。
可清除大部分silver染色过程中出现的background缺点,呈现清晰的结果。
平均拥有比coomassie blue染色高10~100倍以上的敏感度,由于进行质量分析时相对使用蛋白质量较少,可能会出现鉴定较困难的情况。

Image Analysis

结束2DE后从数百产生数千个蛋白质点。
为了甄选其中存在差异的蛋白质,采用普通比较分析方法耗时较长。

Proteome Tech利用凝胶图像分析程序Image master 5.0 (Amersham Biosciences)可迅速搜索存在差异的蛋白质点,提供图像与数据。

另外,根据不同分析方法及客户要求,还可提供其他服务项目。

analysis

2DE 定性 定量 分析

搜索2DE上所有增加蛋白质出现减量(定量分析)的变化趋势。
另外,还可搜索比较程序无法处理的已消失的蛋白质(定性分析)变化。
可以为客户提供统计数据,以及可用于论文或者发表资料的编辑图片。

2DE 简易 分析

根据客户需求甄选限定个数的蛋白质候补群时提供的服务。
即,由于费用问题或根据试验特性,产生变化的蛋白质点较少时进行简易分析的方法。
数据的可靠性与定性定量分析相同。提供统计数据和2DE图片中产生变化的蛋白质点位置和放大图片。

1DE 定量 分析

为了比较普通SDS-PAGE中呈现的带数量而提供的服务。
提供将变化量转为数值数据的服务。

Isoelectric Focusing

所有蛋白质均拥有等电点(等电位点值,pl)。
根据等电点进行分离是二维电泳首先采用的方法,也被称为等电子聚焦(Isoelectric focusing, IEF)。
Proteome Tech为了分离等电点采用IPG (Immobilized pH Gradient) strip。IPG strip上有各种pH范围,可按照需要分离等电点部分的蛋白质。

IPG strip pH range (18 cm标准)
Broad range : pH 3-10 (linear, nonlinear), pH 4-7, pH 6-9
1 unit range : pH 4.5 – 5.5, pH 5.5 – 6.7

虽然可确认的最大范围为pH 3-10,但过高或者过低pI值的蛋白质在2DE上会出现牵引现象。
通常推荐范围为pH 4-7。


IEF Gel running

仅确认蛋白质等电点值时提供的服务。
采用与普通1DE类似形态的IEF Gel(pH 3-10, pH 3-7),按照需要提供蛋白质的pI值。

      IEF Gel

SDS-PAGE

1DE

提供各种浓度的polyacrylamide gel Electrophoresis服务。可进行普通样品间的定量比较及确认免疫沉淀法(immunoprecipitation, IP)、提炼后的蛋白质变化。

通常用于在2DE之前进行定量确认。

1de

2DE

根据等电点分离蛋白质后,制造适合各样品的 % gel,按照蛋白质的分子量分离蛋白质。
通常进行14~18小时,根据样品的特征可采用各种方法进行染色并提供图像。

2de

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