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2-D Electrophoresis

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Sample Preparation

시료 단백질을 1차적으로 등전점에 따라 분리하기 위해서는 시료에서
salt, nucleic acid, polysaccharides, lipid 등을 제거해 주어야 합니다.

특히 salt는 시료의 Methanol precipitation, TCA/acetone precipitation, centricon등을 사용하여 제거해 주어야만 Isoelectrofocusing시 strip이 타버리는 문제가 발생하지 않습니다.

MS compatible silver나 Sypro-Ruby staining을 기준으로 이상적인 단백질
발현분석을 위해서는 100 – 200 ug/gel, Coomassie Blue staining을 위해서는
1- 2 mg/gel의 단백질 양을 필요로 합니다.
(normal gel: 18 cm 기준)시료에 따른 최적 분리 조건을 알기 위해 예비 실험을
해야 될 경우에는 보다 많은 양의 시료를 필요로 합니다.

시료에 따른 단백질의 대략적인 농도
박테리아 건조량의 50%가 단백질량
혈장/혈청 60 mg/ml
1×107 진핵세포 1 mg
Mammalian tissue 동결 건조된 10 mg의 조직에서 1 mg의 시료 단백질 추출 가능
약 500 ml
*MS를 이용한 단백질 동정을 위한 시료를 준비할 때 keratin에 오염되지 않도록 특별한 주의를 요합니다.
*Keratin에 의한 시료의 오염은 단백질 동정에 심각한 영향을 주게 됩니다.
1. MALDI-TOF 분석시 최소 100 ng 이상, LC-ESI MS/MS 분석 시는 3 pmol 이상의 단백질이 필요 합니다.
2. spot의 크기는 직경 1 mm내외의 크기로 최대한도로 작게 젤에서 분리해야 합니다.
3. 시료의 desalting, detergent 제거 및 농축을 위해 ZIP tip 사용을 권장합니다.
(silver staining으로 부터 얻은 시료는 이 과정이 반드시 필요 합니다.)
4. 젤에서 분리한 단백질 밴드는 3차수에 담긴 상태로 1.5 ml tube에 넣어 보내주시면 됩니다.

Gel Staining

전기 영동법에 의해 분리되어진 젤 (1DE, 2DE)은 염색단계를 거치게 됩니다.
염색 시약에 따라 민감도에 차이가 나서 정확한 단백질 위치 및 정량적인 이미지를 보기 위해서는 반드시 고민감도의 염색시약을 사용해야 합니다.

프로테옴텍에서는 염색 시약을 대부분 자체 제작하여 사용하고 있습니다. 축적된 기술적 노하우를 바탕으로 수준 높은 해상도의 이미지를 제공해 드리고 있습니다.

쿠마시 블루 (Coomassie Blue) 염색

프로테옴텍에서는 자체 제작한 CoomassiePro (G250)를 이용하여 고민감도의 이미지를 제공해 드리고 있습니다.
다른 어떤 제품 보다도 민감도가 높으며 4~overnight 동안 염색시간을 두어 좀더 세밀하게 단백질 이미지를 보실 수 있습니다.
또한 질량 분석시에도 탈염색(destaining) 과정이 간단하여 고객님의 소중한 시간을 절약하여 드립니다.
Coomassie blue로 염색된 샘플은 질량 분석시 대부분 동정이 가능합니다.

실버 (Silver) 염색

프로테옴텍에서는 자체적으로 제작한 modified silver 염색을 하고 있습니다.
일반적인 silver 염색의 단점으로 지적되고 있는 background 를 많이 제거 하여 깨끗한 결과물을 확인 하실 수 있습니다.
평균 coomassie blue 염색보다 10~100배 이상의 민감도를 지니고 있어 질량 분석시에는 상대적으로 적은양의 단백질을 사용되기 때문에 동정이 어려운 경우가 있습니다.

Image Analysis

2DE 완료 후에는 수백개에서 수천개의 단백질점이 생기게 됩니다.
이중 차이가 있는 단백질을 선별하기 위해서는 일반적인 비교 분석 방법으로는 많은 시간이 소요가 됩니다.

프로테옴텍에서는 젤 이미지 분석 프로그램인 Image master 5.0 (Amersham Biosciences)을 이용하여 빠른 시간안에 차이가 있는 단백질점들을 검색하여 이미지 및 데이터를 제공하고 있습니다.

또한 분석 방법에 따라, 고객의 요청에 따라 서비스 항목을 달리 하여 서비스 하고 있습니다.

analysis

2DE 정성 정량 분석

2DE 상의 모든 단백질을 증가 감소 (정량 분석) 변화를 검색합니다.
또한 비교 프로그램으로 처리 할 수 없는 사라지는 단백질 (정성 분석) 변화도 검색합니다.
통계적인 수치 데이터는 물론 고객께서 논문이나 발표자료에 활용할 수 있도록 편집한 이미지를 제공해 드립니다.

2DE 간이 분석

고객에 요청에 따라 한정된 개수의 단백질 후보군을 선별할 때 제공되는 서비스 입니다.
즉 비용적인 문제나 실험의 특성상 개수가 적고 변화하는 단백질점이 적을 때 간이적으로 분석하는 방법입니다.
데이터의 신뢰성은 정성 정량 분석과 동일합니다. 통계적인 수치 데이터와 2DE 이미지에서 변화되는 단백질점의 위치와 확대한 그림이 제공됩니다.

1DE 정량 분석

일반적인 SDS-PAGE에서 보이는 밴드의 양적인 비교를 위해 제공되는 서비스 입니다.
변화하는 양을 수치적 데이터로 만들어 서비스 하고 있습니다.

Isoelectric Focusing

모든 단백질은 고유 등전점 (등전위점값, pI)을 가지고 있습니다.
등전점에 따른 분리는 이차원 전기영동에 가장 먼저 수행되는 방법으로 일명 등전위점 초점화 (Isoelectric focusing, IEF) 라고 합니다.

프로테옴텍에서는 등전점 분리를 위해 IPG (Immobilized pH Gradient) strip를 사용하고 있습니다. IPG strip에는 다양한 pH 범위가 있어 원하는 등전점 부분의 단백질을 분리 할 수 있습니다.

IPG DryStrip pH range (18 cm 기준)
Broad range : pH 3 – 10 (linear, nonlinear), pH 4 – 7, pH 6 – 9
1 unit range : pH 4.5 – 5.5, pH 5.5 – 6.7

가장 넓게 확인 하실 수 있는 범위는 pH 3 – 10지만 너무 높고 낮은 pI값의 단백질들은 2DE 상에서 끌리는 현상이 자주 발생하게 됩니다.
일반적으로 pH 4 – 7를 추천하여 드립니다.


IEF Gel running

단백질의 등전점 값만을 확인 할 경우 제공되는 서비스 입니다.
일반 1DE 과 비슷한 형태의 IEF Gel (pH 3-10, pH 3-7)을 사용하여 원하시는 단백질의 pI값을 알려드립니다.

      IEF Gel

SDS-PAGE

1DE

다양한 농도의 Polyacrylamide Gel Electrophoresis 서비스를 제공합니다. 일반적인 샘플간의 정량적 비교 및 면역침강법 (immunoprecipitation, IP), 정제 후 단백질의 변화를 확인하실 수 있습니다.
2DE 이전에 정량적인 확인을 위해 기본적으로 사용됩니다.

1de

2DE

등전점에 의한 단백질의 분리 후 각각의 샘플에 알맞은 %의 gel을 제조하여 단백질의 분자량에 따라 단백질을 분리하게 됩니다.
일반적으로 14~18시간 진행되며 샘플의 특징에 따라 다양한 방법으로 염색하여 이미지를 제공하여 드립니다.

2de

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